ما هو اختبار PCR؟
اختبار PCR هو طريقة مختبرية تستخدم في البيولوجيا الجزيئية والطب. يُستخدم الاختبار للكشف المباشر عن المواد الوراثية وتوصيفها. يعتبر الخبراء أن طريقة PCR سهلة الأداء وقابلة للتطبيق عالميًا وقوية.
في المختبر، يتكون اختبار PCR من خطوتين. في الخطوة الأولى، يتم تضخيم المادة الوراثية الموجودة باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). وهذا يسمح بفحص أصغر آثار الحمض النووي. وهذا أيضًا هو السبب وراء تفاعل اختبارات PCR بحساسية شديدة.
وفي خطوة ثانية يتم فصل المادة الوراثية حسب خصائصها و"فرزها" وبالتالي توصيفها. وبعبارة أخرى، يتم تحديد البنية الدقيقة للحمض النووي.
هناك العديد من التطبيقات الممكنة: يستخدم الأطباء اختبار PCR، على سبيل المثال، لفحص المسحات بحثًا عن وجود فيروسات كورونا، أو التبرع بالدم لفيروس نقص المناعة البشرية أو فحص الأطفال حديثي الولادة بحثًا عن أمراض وراثية محتملة. يمكن أيضًا توضيح الالتهابات البكتيرية – على سبيل المثال مع مسببات مرض السل – أو الالتهابات الطفيلية (الملاريا) باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل.
كما أنها تساعد في إدانة الجناة في الطب الشرعي على أساس بصماتهم الجينية أو تستخدم كاختبارات للأبوة.
ما هي مدة صلاحية اختبار PCR؟
عادة ما تكون نتيجة اختبار PCR صالحة لمدة 48 ساعة من وقت أخذ العينة.
ما مدى موثوقية اختبار PCR؟
PCR هي طريقة كشف مجربة ومختبرة في التشخيص الجزيئي والطب. ويعتبر ما يسمى بالمعيار الذهبي مع معدل خطأ منخفض للغاية. وتتميز الاختبارات بشكل خاص بالحساسية والنوعية العالية جدًا.
الحساسية تعني الموثوقية التي يجد بها الاختبار المادة الوراثية المراد اكتشافها.
الخصوصية تعني اليقين الذي يحدد به الاختبار أن المادة الوراثية المعنية غير موجودة في العينة.
متى تعمل اختبارات PCR لعدوى Sars-CoV-2؟
كقاعدة عامة، يكشف اختبار PCR عن الإصابة بكورونا قبل يومين إلى ثلاثة أيام من ظهور الأعراض وحتى 20 يومًا بعد ظهور الأعراض. حتى في الأشخاص المصابين الذين يظلون خاليين تمامًا من الأعراض، يكون الاختبار فعالًا في فترة زمنية حرجة عندما يمكنهم نقل العدوى للآخرين.
وفي الحالات الفردية، يكون الكشف ممكنًا بعد 60 يومًا من ظهور الأعراض.
مصادر الخطأ المحتملة
معدل الخطأ في عملية نسخ الحمض النووي لا يكاد يذكر في الممارسة العملية. على الرغم من أن بوليمرات الحمض النووي لا تخلو أبدًا من الأخطاء، إلا أنها بالكاد تلعب دورًا في إجراء اختبار PCR.
ومن الناحية العملية، تكمن مصادر الخطأ المحتملة بشكل أكبر في جمع العينات: لذلك من المهم أن يقوم متخصصون طبيون مدربون بإجراء المسحات. يمكن لعينات اللعاب والغرغرة أن تقلل من دقة الاختبار، حيث تحدث تأثيرات التخفيف هنا.
كيف يعمل اختبار PCR؟
يتم إجراء اختبار PCR، على سبيل المثال، من قبل طبيب الأسرة أو في مراكز الاختبار الخاصة. أولاً، يأخذ الأطباء أو المهنيون الطبيون المدربون عينة. عادة ما يتم أخذ مسحة من الجهاز التنفسي العلوي للاختبار. وعادة ما يأخذ هذا شكل مسحة من الفم أو البلعوم.
من الممكن أيضًا الغرغرة بمحلول الشطف. تعتبر عينة الدم غير معتادة للكشف عن كورونا – ولكنها تستخدم على نطاق واسع في فحص حديثي الولادة، على سبيل المثال.
وبغض النظر عن نوع العينة المأخوذة، فإن المادة الوراثية موجودة على قطعة القطن أو في محلول الشطف أو في قطرة الدم. يتم إرسال مادة العينة هذه إلى المختبر، حيث يتم عزلها وتنقيتها.
يتم بعد ذلك تقسيم اختبار PCR إلى خطوتين:
- PCR: في هذه الخطوة، يتم تضخيم كمية المادة الوراثية الأولية.
الخطوة 1: PCR - "تفاعل البوليميراز المتسلسل"
"PCR" هو أول خطوتين: حيث يتم تضخيم كمية الحمض النووي البادئ المتاحة. وذلك لأن المادة الوراثية لا يمكن تحليلها إلا بعد توفرها بكميات كافية. في معظم الحالات، هذا هو الحمض النووي البشري. وفي حالة اختبارات فيروس كورونا، فهو الحمض النووي الريبوزي الفيروسي.
يشير الاختصار PCR إلى تفاعل البلمرة المتسلسل.
ما هو المطلوب لإجراء PCR؟
يتم وضع الحمض النووي البادئ في وعاء التفاعل بمواد خاصة. تعمل المادة الوراثية الموجودة كقالب، حيث يتم نسخها في وجود إنزيمات معينة (بوليميراز طق) وبعض وحدات بناء الحمض النووي الأساسية.
تتم عملية النسخ في عدة دورات (دورات) متكررة.
وعلى وجه التحديد، يتم إضافة المواد التالية معًا:
- الحمض النووي البادئ: عينة المادة المراد نسخها.
- لبنات بناء الحمض النووي الأساسية: هذه هي القواعد النووية الأدينين والثايمين والسيتوزين والجوانين.
- بوليميريز الحمض النووي: إنزيم يربط وحدات بناء الحمض النووي الفردية لتشكيل شريط DNA محدد جيدًا. الشريط الذي تم الحصول عليه حديثًا هو صورة طبق الأصل (مكملة) للمادة الأولية الأصلية.
- البادئات: تتكون من 16 إلى 24 زوجًا أساسيًا وتكون بمثابة نقطة البداية وإشارة البداية. تُظهر البادئات بوليميراز الحمض النووي (DNA) عند أي موضع (الحمض النووي البادئ) تبدأ عملية النسخ.
كيف يتم إجراء اختبار تفاعل البوليميراز المتسلسل؟
الآن بعد أن أصبحت جميع المواد المطلوبة لـ PCR موجودة في وعاء التفاعل، يمكن أن تبدأ عملية النسخ الفعلية للمادة الوراثية. يتم بدء هذا الأمر والتحكم فيه وإيقافه مرة أخرى فقط عن طريق درجة الحرارة.
ولذلك يتم تسخين وعاء التفاعل أو تبريده إلى درجات حرارة مختلفة الواحدة تلو الأخرى. ويتم ذلك باستخدام جهاز خاص يعرف باسم التدوير الحراري. يستغرق التفاعل بأكمله حوالي ساعة إلى ساعتين.
الخطوات الفردية لدورة PCR هي
- تمسخ خيوط الحمض النووي المزدوجة: يتم تسخين العينة إلى حوالي 90 درجة مئوية. يؤدي هذا إلى فصل شريط الحمض النووي المزدوج الأصلي إلى شريطين فرديين (مكملين) منفردين.
- مرفق البادئات: يتم خفض درجة الحرارة إلى أقل بقليل من 60 درجة مئوية. يؤدي هذا إلى ربط البادئات (التمهيدي الأمامي، التمهيدي العكسي) بمواضع محددة على خيوط الحمض النووي الفردية المقابلة.
بعد انتهاء الدورة، يتم رفع درجة الحرارة مرة أخرى إلى حوالي 90 درجة مئوية - وتبدأ الدورة مرة أخرى من البداية.
يمكن استخدام طريقة PCR لتضخيم تسلسل الحمض النووي لما يصل إلى حوالي ثلاثة أزواج كيلو قاعدة (kbp). وهذا يتوافق مع حوالي 3,000 وحدة بناء أساسية للحمض النووي مرتبطة ببعضها البعض لتشكل "سلسلة". للمقارنة: يخزن الجينوم البشري المخططات والمعلومات اللازمة لتشغيل الخلية في حوالي ثلاثة مليارات زوج أساسي - من ناحية أخرى، يتكون جينوم الفيروس التاجي من 30,000 ألف زوج أساسي. وبالتالي فإن اختبار PCR لا يمكنه إلا تضخيم وفحص أجزاء قصيرة من الحمض النووي الإجمالي.
الاشعال حاسمة
يعد اختيار الاشعال أمرًا بالغ الأهمية لإجراء PCR. في تشخيص Sars-CoV-2، على سبيل المثال، يتم استخدام العديد من البادئات (PCR المتعدد).
وبالتالي، تبحث اختبارات كورونا PCR عن ثلاثة جينات مختلفة للفيروس: وهذا يزيد من الخصوصية الإجمالية إلى ما يقرب من 99.99%. وهذا يعني أنه مع معدل الإصابة المرتفع هذا، يوجد اختبار إيجابي كاذب واحد فقط لكل 10,000 اختبار (إذا تم أخذ العينات بشكل صحيح).
ما هي كمية المادة الوراثية المنسوخة المتوفرة الآن؟
لنفترض أن شريطين مزدوجين متطابقين من الحمض النووي موجودان بعد الدورة الأولى.
وبعد كل دورة تتضاعف كمية المادة الوراثية (المنسوخة). وبالتالي فإن كمية الحمض النووي تنمو بشكل كبير.
يكرر الأطباء عادة هذه العملية حوالي عشرين إلى ثلاثين مرة.
من الناحية المجازية، هذا يعني أنه حتى لو تم العثور على شريط مزدوج واحد فقط من الحمض النووي في العينة في البداية، فبعد عشرين دورة يوجد بالفعل مليون نسخة متطابقة في وعاء التفاعل.
ماذا تعني قيمة Ct؟
تتم الإشارة إلى عدد دورات PCR التي يتم تشغيلها في شكل ما يسمى بقيمة Ct. "Ct" مشتق من المصطلح الإنجليزي "عتبة الدورة". تتيح قيمة Ct هذه إمكانية الإدلاء ببيانات حول كمية المادة الوراثية التي يتم البحث عنها.
مع قيمة Ct منخفضة تبلغ 20، هناك الكثير من المواد الوراثية البادئة. ومع ذلك، إذا كانت قيمة Ct عالية – حوالي 30 دورة – يكون هناك القليل من الحمض النووي. ولذلك يجب تشغيل دورة PCR في كثير من الأحيان.
الخطوة 2: الرحلان الكهربائي "الفرز حسب الحجم"
وبمجرد توفر ما يكفي من المادة الوراثية "المخصبة"، يمكن إجراء عملية الرحلان الكهربائي. في هذه العملية، يستغل العلماء خاصية محددة للحمض النووي: شحنته الكهربائية.
ترتبط وحدات بناء الحمض النووي الفردية ببعضها البعض عبر العمود الفقري للسكر والفوسفات المشحون (سلبيًا). كلما زاد طول تسلسل الحمض النووي، زادت شحنته الكهربائية.
وهذا يسمح بفحص المادة الوراثية وتوصيفها. ومن الناحية العملية، عادة ما يتم رسم عينة غير معروفة مقابل مرجع معروف على "خط البداية" ومقارنتها ببعضها البعض بعد فترة زمنية معينة.
إذا كانت "سرعة الهجرة" هي نفسها لكلا التسلسلين، فهذا يعني أن الكشف على الأرجح إيجابي: من المحتمل جدًا أن يكون الاكتشاف إيجابيًا - فالجين الذي تبحث عنه موجود في العينة.
حالة خاصة من فيروس كورونا: تحضير العينة وRT-PCR
يعد اكتشاف فيروس كورونا حالة خاصة. Sars-CoV-2 هو أحد ما يسمى بفيروسات RNA. وهذا يعني أن المادة الوراثية لـ Sars-CoV-2 موجودة على شكل RNA (الحمض النووي الريبي).
يختلف الحمض النووي الريبوزي (RNA) عن الحمض النووي (DNA) في بعض النواحي فقط. من بين أشياء أخرى، فهو موجود كشريط واحد ويعتمد على سكر الريبوز بدلاً من 2′-deoxyribose. يتم أيضًا استبدال الثايمين النووي باليوراسيل كقاعدة رابعة.
ويجب "نسخ" هذا الحمض النووي الريبوزي الفيروسي إلى الحمض النووي قبل إجراء اختبار PCR منتظم. تُسمى هذه العملية بالنسخ العكسي (RT) – ومن هنا جاء مصطلح RT-PCR. يتم الحصول على شريط واحد من [كدنا] ("الحمض النووي التكميلي") كجزء من هذه العملية. وفي خطوة أخرى، يتم استكمال شريط cDNA المفرد بشريط DNA ثانٍ على شكل صورة معكوسة.
كم من الوقت يستغرق الحصول على النتيجة؟
بمجرد إرسال العينة إلى المختبر، ستتلقى عادةً النتيجة خلال يوم أو يومين عمل. في مراكز الاختبار، التي غالبًا ما تقوم بفحص العينات مباشرةً في الموقع، قد يستغرق الأمر أيضًا بضع ساعات فقط. تعتمد الفترة الزمنية إلى حد كبير على مركز الاختبار المعني ولوجستياته.
على الرغم من عمليات العمل المعقدة، فإن المختبرات الحديثة قادرة على إجراء اختبارات PCR بإنتاجية عالية. تساعد الأجهزة الآلية الخاصة في إجراء الاختبارات.
ومع ذلك، يعتبر اختبار PCR طريقة كشف "بطيئة" نسبيًا ولكنها أكثر موثوقية.
ماذا يحدث إذا كانت النتيجة إيجابية؟
إذا تم أخذ العينة بشكل صحيح، فإن نتيجة اختبار PCR إيجابية تعني أن هناك احتمالًا كبيرًا جدًا أن يكون الشخص الذي تم اختباره مصابًا بفيروس Sars-CoV-2.
إذا تم التأكد من إصابتك بفيروس كورونا باستخدام اختبار PCR، فستتلقى إدارة الصحة العامة إخطارًا بنتيجة الاختبار الإيجابية من المختبر المعني. في مثل هذه الحالة، ستأمر إدارة الصحة العامة بالعزل أو الحجر الصحي.
هل أنا معدٍ تلقائيًا إذا كانت نتيجة اختبار PCR إيجابية؟
عادة نعم. لكن ليس دائما. يجب دائمًا تفسير نتيجة اختبار PCR في سياقها. الاختبار الإيجابي يعني أولاً وقبل كل شيء أنك تحمل مادة فيروسية.
يكون اختبار الأجسام المضادة التكميلي مفيدًا في بعض الأحيان
في مثل هذه الحالات، يوفر اختبار الأجسام المضادة اليقين الذي يؤكد صحة اختبار PCR. ومن الأفضل مناقشة هذا الأمر مع طبيبك. يمكنهم مساعدتك في تفسير نتيجة اختبار PCR بشكل صحيح.
ماذا تفعل إذا كانت النتيجة سلبية؟
على الأرجح أن نتيجة اختبار PCR السلبية تعني أنك لم تكن مصابًا بـ Covid-19 في وقت أخذ العينة وبالتالي لست معديًا حاليًا. ومع ذلك، يمكن أن تكون في مرحلة مبكرة من العدوى.
عادة لا يمكن اكتشاف عدوى كورونا إلا من اليوم الثاني أو الثالث بعد الإصابة. وبالتالي فإن النتيجة ليست تمريرة مجانية. لذلك يجب عليك الاستمرار في مراعاة قواعد التباعد الاجتماعي والنظافة والاستمرار في ارتداء قناع FFP2 – لحمايتك وحماية الآخرين.
اختبار PCR للأطفال
لا يختلف اختبار PCR للأطفال عن اختبار PCR للبالغين. ينطبق كل من جمع العينات وتفسير النتائج على الأطفال وكذلك البالغين.
ما هي مخاطر اختبار PCR؟
لا ينطوي اختبار PCR على أي مخاطر جسدية. فقط جمع العينة عن طريق مسحة من البلعوم الأنفي هو ما ينظر إليه بعض الناس على أنه أمر مزعج أو مزعج.
ما هي تكلفة اختبار PCR؟
يرجى ملاحظة: إذا قمت باختبار نفسك في المنزل وحصلت على نتيجة إيجابية، فيجب عليك تحديد موعد مع طبيبك العام عبر الهاتف على الفور. سوف يناقش طبيبك الخطوات التالية معك عبر الهاتف.
وبدلاً من ذلك، من الأفضل الاتصال بالرقم 116 للتسجيل لإجراء اختبار PCR. من الناحية المثالية، يجب عليك البقاء في المنزل حتى إجراء اختبار التأكيد لحماية نفسك والآخرين.
